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ProteanFect:小鼠原代T細(xì)胞從提取到轉(zhuǎn)染全流程攻略

更新時(shí)間:2025-01-15 點(diǎn)擊次數(shù):1204
小鼠原代T細(xì)胞一般從脾臟組織中得到,包括脾臟研磨、細(xì)胞分離、純化T細(xì)胞等步驟。以下是常用的小鼠原代T細(xì)胞提取流程:

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

  1. 材料與試劑:新鮮小鼠脾臟、PBS緩沖液、無(wú)菌手術(shù)器械(剪刀、鑷子等)、細(xì)胞過(guò)濾器、CD4/CD8磁珠分選試劑(如需純化特定亞型),或陰選的方式去除B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞的磁珠分選試劑,RPMI-1640培養(yǎng)基,人白介素2,胎牛血清,抗生素(如青霉素-鏈霉素)。
  2. 設(shè)備:無(wú)菌操作臺(tái)、離心機(jī)、磁力分選架。

從小鼠脾臟獲取單細(xì)胞懸液

  1. 小鼠頸椎脫臼處死,75%乙醇浸泡5分鐘,取出小鼠置于無(wú)菌操作臺(tái)上,左腹側(cè)朝上。
  2. 在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口,撕開皮膚暴露腹壁,可見紅色長(zhǎng)條狀脾臟。
  3. 在脾臟下側(cè)提起腹膜,剪開后上翻,暴露脾臟,用鑷子提起脾臟,眼科剪分離下面的結(jié)締組織,取出脾臟,剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織,期間用含有2%FBS的PBS溶液保持脾臟濕潤(rùn)。
  4. 將脾臟放于70UM過(guò)濾網(wǎng)中,用注射器針芯輕輕研壓脾臟,用含2%FBS的PBS沖洗過(guò)濾網(wǎng),獲細(xì)胞懸液。
  5. 300G離心5分鐘,收集細(xì)胞沉淀,然后加入紅細(xì)胞裂解液裂解,將紅細(xì)胞充分裂解,收集白細(xì)胞。

從單細(xì)胞懸液中分離小鼠原代T細(xì)胞

  1. 全T細(xì)胞分離:利用陰選的方式去除B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞等,按照分選試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。
  2. 亞群分離(如需要CD4+或CD8+ T細(xì)胞):
    • 使用CD4或CD8磁珠(如MACS磁珠)分選獲得特定T細(xì)胞亞群。
    • 將磁珠標(biāo)記的細(xì)胞懸液置于磁性分選裝置中,分離出目標(biāo)T細(xì)胞亞群。

培養(yǎng)與檢測(cè)

  1. 將分離的T細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,并加入抗生素與人白介素2。
  2. 細(xì)胞密度一般控制在1-2×10^6 CELLS/ML,放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染

西湖凝聚體推出針對(duì)小鼠原代T的PT03 PROTEANFECT MAX小鼠原代T細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒。使用ProteanFect Max遞送EGFP mRNA至小鼠原代T細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。

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