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怎么使用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基

更新時(shí)間:2015-08-11 點(diǎn)擊次數(shù):1309
     干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和試劑在培育無(wú)脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)備置單克隆抗體方面被廣泛的應(yīng)用,還有病毒抗原和重組蛋白等。干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基是不用增加血清就能夠保持細(xì)胞在體外比較長(zhǎng)時(shí)刻成長(zhǎng)繁衍的組成培養(yǎng)基。
    大部分的干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基擁有向細(xì)胞中轉(zhuǎn)輸離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白和調(diào)理葡萄糖攝取量的胰島素,還有一部分蛋白質(zhì)和清蛋白,纖維蛋白,胎球蛋白等,綜上所指的蛋白在細(xì)胞培育中具有各自不一樣的功用,如供給細(xì)胞貼壁所要的基質(zhì),抗生物反應(yīng)器剪切力,供給細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì),作為脂類和其他生長(zhǎng)因子的載體等。
    干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞以制備單克隆抗體,病毒抗原和重組蛋白等。大多數(shù)的無(wú)血清培養(yǎng)基含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素,以及一些蛋白質(zhì)和清蛋白,纖維蛋白,胎球蛋白等,這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同的功能,如提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì),抗生物反應(yīng)器剪切力,作為脂質(zhì)和其他生長(zhǎng)分化因子的載體等。
   

使用方法

    目前,血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物,尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí),常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后,再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低過(guò)程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化,是否有部分細(xì)胞死亡,存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留,很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前,要留有種子細(xì)胞,種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中,以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。
    為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng),關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞:
    1.處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期
    2.>90% 活細(xì)胞率
    3.適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種
    細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的方法
    1.直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中。
    一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng),接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10~3.5×10細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml時(shí),傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×10~4×10細(xì)胞/ml時(shí),細(xì)胞*適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔3~5天,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90%時(shí),貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
    2.連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中,與直接適應(yīng)相比較,連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。
    (1)以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)。
    (2)當(dāng)細(xì)胞密度>5×10細(xì)胞/ml時(shí),以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
    (3)以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。
    (4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml(接種后4到6天),在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
    (5)每隔3到5天,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90%時(shí),貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
    建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。
    在適應(yīng)過(guò)程中,不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養(yǎng)基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),因而更易于受外界因素的影響。
    細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清:許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng),用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1(v∶v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式,連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量:1∶2,1∶4,1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí),傳代細(xì)胞2到3次。
    培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生,4允許進(jìn)行2到3次的傳代,使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。
    特別需要強(qiáng)調(diào)的是:配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水,如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子,既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微,也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。
 

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