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細胞適應(yīng)干細胞無血清培養(yǎng)基的方法

更新時間:2015-09-23 點擊次數(shù):1600
     血清仍是動物細胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物,尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時,常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng),待細胞生長旺盛以后,再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化,是否有部分細胞死亡,存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留,很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。
    干細胞無血清培養(yǎng)基采用經(jīng)過優(yōu)化的配方配制,不含血清,無異源動物成分,且化學(xué)成分明確。適用于多種人來源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)。經(jīng)驗證,在S&XFM-CDTM間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)條件下,間充質(zhì)干細胞能快速生長,且能有效的維持間充質(zhì)干細胞的形態(tài)、表型和分化能力。
   

細胞適應(yīng)干細胞無血清培養(yǎng)基的方法:

    1.直接適應(yīng)——細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中。
    一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng),接種細胞密度應(yīng)該:2.5×10~3.5×10細胞/ml。當(dāng)細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml時,傳代培養(yǎng)細胞。當(dāng)細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×10~4×10細胞/ml時,細胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天,當(dāng)細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
    2.連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中,與直接適應(yīng)相比較,連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩毎訙睾鸵恍?/div>
    (1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)。
    (2)當(dāng)細胞密度>5×10細胞/ml時,以2×10到3×10細胞/ml細胞密度,在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
    (3)以2×10到3×10細胞/ml細胞密度,25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。
    (4)當(dāng)細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml(接種后4到6天),在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
    (5)每隔3到5天,當(dāng)細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
    建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,直到每一次細胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。
    在適應(yīng)過程中,不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養(yǎng)基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),因而更易于受外界因素的影響。
    細胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清:許多細胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng),用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1(v∶v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式,連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量:1∶2,1∶4,1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時,傳代細胞2到3次。
    培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長的延遲可能會發(fā)生,4允許進行2到3次的傳代,使生長率恢復(fù)到以前的水平。
    特別需要強調(diào)的是:配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水,如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子,既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微,也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。
 

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